Corso di Laurea in Biotecnologie

Biotecnologie Cellulari

Anno accademico 2010/2011

Sommario insegnamento

• Programma
• Testi consigliati e bibliografia
• Note
• Strumenti didattici

Programma

1)      Le colture cellulari: le colture primarie, le linee stabilizzate, le cellule immortalizzate, gli ibridomi, le cellule staminali.

2)      L’analisi delle proteine cellulari in vitro (saggi qualitativi e quantitativi): estrazione e purificazione delle proteine; analisi delle proteine mediante elettroforesi unidimensionale e bidimensionale, immunoprecipitazione, Western blotting, marcatura metabolica e saggi radioimmunologici, analisi dello stato di attivazione di proteine con funzioni regolatrici, saggi di attività chinasica. Le applicazioni di spettrometria di massa. Studi di interazione proteina-proteina: i saggi di “pull-down”; la tecnica del doppio ibrido.

3)      Le proteine ricombinanti: i sistemi di espressione procariotici ed eucariotici, la produzione e purificazione proteine di fusione, gli impieghi delle proteine di fusione.

Esempio: Produzione di agenti terapeutici per l’uomo.

4)      La trasfezione delle cellule eucariotiche per l’espressione di proteine di interesse: tecnica del Ca2+/fosfato, tecnica del DEAE-dextrano, i liposomi, l’elettroporazione, i vettori virali.

Esempio: I sistemi virali per la terapia genica ex vivo ed in vivo.

5)      I controlli post-trascrizionali dei livelli di espressione delle proteine. Il miglioramento della stabilità delle proteine.

Esempio: La modulazione dell’espressione e funzione dei recettori adesivi.

6)      L’analisi delle proteine cellulari in vivo (localizzazione, dinamiche subcellulari e funzioni): microscopia ottica convenzionale e confocale; tecniche di immunofluorescenza ed immunocitochimica; l’uso delle proteine di fusione per l’analisi delle funzioni delle proteine; tecniche di microscopia a multifluorescenza in “time-lapse” per l’analisi delle dinamiche molecolari.

Le tecniche “F” e le loro applicazioni: “Fluorescence Resonance Energy Transfer” (FRET), “Fluorescence Recovery After Photobleaching” (FRAP), “Fluorescence Loss In Photobleaching” (FLIP).

Esempio: I meccanismi di regolazione della traslocazione nucleo-citoplasma di proteine.

Esercitazioni di laboratorio sulle tecniche trattate.

1) Alberts et al.- “Biologia Molecolare della Cellula” – Zanichelli. 2) Glick e Pasternak – “Biotecnologia Molecolare” – Zanichelli. 3) Reed et al.- “Metodologie di base per le Scienze Biomolecolari” - Zanichelli. 4) Ninfa e Ballou - “Metodologie di base per la Biochimica e la Biotecnologia” - Zanichelli. 5) Articoli forniti dal docente.

Note

Lezioni frontali (16 ore). Esercitazioni (32 ore) Modalità d’esame: seminari degli studenti sugli argomenti svolti a lezione + prova orale

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