Corso di Laurea in Biotecnologie

CORSO DI TECNICHE DI LABORATORIO INTEGRATE

Anno accademico 2011/2012

Sommario insegnamento

• Obiettivi formativi
• Programma
• Strumenti didattici

Obiettivi formativi

Lo scopo del corso è fornire una approfondita conoscenza delle principali metodiche sperimentali utilizzate nell'ambito della ricerca biologica di base e applicata. In particolare, l'insegnamento metterà in evidenza come le divrse tecnologie possono essere integrate per rispondere a complessi quesiti biologici.

Programma

Programma corso Tecniche di Laboratorio Integrate

Tecniche di biologia cellulare

Paola Defilippi: (03/10 – 17/10)

- Le colture cellulari

1. Come si coltivano le cellule in laboratorio: concetti e metodologie di base
2. Colture primarie da tessuti e colture cellulari immortalizzate
3. Purificazione e caratterizzazione di sottotipi cellulari specifici: la ghiandola mammaria
4. Linee di cellule tumorali
5. Ibridomi e produzione degli anticorpi monoclonali

- Espressione di proteine d’interesse in batteri e in cellule eucariote. Tecniche di trasfezione:

1. Ca2+/ fosfato
2. DEAE dextrano
3. Liposomi come sistema di trasfezione
4. Elettroporazione
5. Vettori virali
6. Produzione di proteine ricombinanti nei batteri

- Analisi delle proteine cellulari in vivo (localizzazione e funzione)

1. Lo studio delle proteine con il microscopio ottico e confocale
2. Immunofluorescenza in cellule
3. L’uso delle proteine chimeriche nello studio delle proteine in vivo
4. Immunocitochimica in tessuti

- Saggi funzionali nella biologia cellulare:

1. Saggi di attività chinasica di recettori di membrana e valutazione delle risposte segnalatorie nella cellula
2. Interazioni di proteine cellulari analizzate in vitro per pull down
3. Interazioni di proteine cellulari analizzate in vivo con tecniche di FRET
4. Saggi di proliferazione
5. Saggi di migrazione
6. Saggi di invasione
7. Tumorigenesi in vitro e in vivo

Tecniche di biologia molecolare

Valeria Poli (18/10 – 25/10)

- Principali approcci per la quantificazione dell’RNA

- Caratterizzazione dei promotori eucariotici

- Saggi trascrizionali con geni reporter

- Approcci per il clonaggio di fattori trascrizionali

- Interazione DNA-proteine:

1. EMSA
2. Footprint da DNAsi I
3. Footprint genomico

-          Analisi della cromatina:

1. Saggio di ipersensibilita’ alla DNAsi I
2. Analisi del posizionamento dei nucleosomi
3. Analisi dei saggi di cui sopra tramite PCR mediata da ligasi
4. Saggi di ImmunoPrecipitazione della Cromatina (ChIP) specifici e genome-wide (ChIP on CHIP, ChIP and Seq)
5. Analisi del posizionamento dei geni nel nucleo (Chromosome Conformation Capture (3C), Chromosome Conformation Capture on CHIP (4C)

Massimo Santoro (26/10 – 31/10)

-         Determinazione della localizzazione spaziale dell’RNA in cellule e tessuti

-         Clonaggio per ricombinazione

Ferdinando Di Cunto (02/11 – 9/11)

-         Tecnologie di deep sequencing e loro applicazione all’analisi genome-wide della regolazione genica.

-         Integrazione di dati genome-wide mediante browser genomici

-         Definizione del significato funzionale dei cambiamenti della sequenza del DNA

Tecniche biochimiche

Francesca Silvagno: (14/11 – 28/11)

- Preparazione di un estratto proteico

- Sistemi tampone

- Quantificazione del contenuto proteico

- Cenni sulle tecniche di centrifugazione

- Separazione e purificazione delle proteine:

1.      Elettroforesi (SDS-PAGE) e detection (colorazione ed ECL)

2.      Cromatografie

3.      Immunoprecipitazione

- Applicazioni delle tecniche di blotting 

1.      Western blotting

2.      Lectin overlay assay

3.      Far-western blotting

4.      Western ligand blotting)

Tecniche fisiologiche applicate alla biologia cellulare

Filippo Tempia: (29/11 – 6/12)

 - Tecniche ottiche di misurazione di concentrazioni ioniche e di

voltaggio, basate su indicatori fluorescenti

- Cenni sulla microscopia "dual photon"

- Tecnica di applicazione rapida di sostanze mediante fotolisi di "caged

compounds"

- Elettrofisiologia: registrazioni extracellulari, intracellulari,

patch-clamp, voltage-clamp e current-clamp

Gestione dei modelli sperimentali animali 

Flavio Cristofani: (7/12 – 21/12)

-         Legislazione vigente in materia di protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici.

-         Linee guida per la sistemazione e la tutela degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici.

-         Linee guida per l’organizzazione e la gestione di uno stabulario.

-         Tecniche di gestione dei piu’ comuni animali da laboratorio(roditori): stabulazione, manipolazione, somministrazione di sostanze, tecniche eutanasiche e malattie.

Seminari integrativi 9-10 e 11 gennaio 2012

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