- Oggetto:
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Metodologie Biochimiche
- Oggetto:
Anno accademico 2008/2009
- Codice dell'attività didattica
- B8059
- Docente
- Dott. Francesca Valetti (Titolare del corso)
- Corso di studi
- laurea i^ liv. in biotecnologie - a torino
- Anno
- 3° anno
- Tipologia
- Indirizzo Industriale
- Crediti/Valenza
- 6
- SSD dell'attività didattica
- BIO/10 - biochimica
- Oggetto:
Sommario insegnamento
- Oggetto:
Programma
Introduzione: la cellula come unità funzionale e composti biologici da analizzare e caratterizzare. Condizioni da rispettare in vitro
Tecniche di estrazione di macromolecole: tessuti animali e vegetali (tecniche di omogeneizzazione), organismi monocellulari (colture microbiche). Metodi di recupero di proteine esocellulari, endocellulari e di membrana. Tecniche di lisi di pareti e membrane. Proteine espresse in sistemi diversi da quello naturale
Metodi di dosaggio proteico ( Lowry, Bradford, acido bicinconinico) e valutazione dell’attività enzimatica.
Tecniche di precipitazione. Precipitazione isoelettrica, con solventi, metalli, PEG. Solubilità delle proteine e precipitazione salina ( saltino in e saltino out). Filtrazione, dialisi, concentrazione del campione. Congelamento e liofilizzazione
Tecniche cromatografiche: cromatografia su strato sottile. Cromatografie su colonna: scambio ionico, interazioni idrofobiche, gel filtrazione, affinità, cromatofocusing. HPLC, FPLC, gas-cromatografie.
Tecniche elettroforetiche, SDS-PAGE, isoelettrofocalizzazione, elettroforesi bidimensionale. Colorazioni specifiche e aspecifiche per elettroforesi di proteine e glicoproteine. Tecniche di densitometria, elettroeluizione, blotting ed elettroblotting.
Struttura primaria di una proteina Composizione in aminoacidi, degradazione di Edman. Sequenze N- terminali e sequenze interne. Scelta delle proteasi
Tecniche di spettrometria di massa (PMF con Maldi, ESI-Ion trap)
Struttura secondaria e terziaria di una proteina e valutazione di metalli catalitici e strutturali e di centri redox: dicroismo circolare, NMR, EPR, spettroscopia di assorbimento atomico, ENDOOR; EXAFS, RAMAN, voltammetria ciclica e titolazione spettroelettrochimica.
Evidenziazione di componenti glicidiche legate a proteine: siti di glicosilazione, glicidi N e O linked, sequenze glicidiche, evidenziazione con tecniche di spot-test (PAS e immunoperossidasi).
Tecniche spettrofotometriche e spettrofluorimetriche.
Metodi di cristallizzazione di proteine a confronto e determinazione della struttura per diffrattometria.
Introduzione all’allestimento di sensori proteici.
Esercitazioni:
1) Cromatografia di affinità per la purificazione di un enzima espresso come proteina di fusione su Glutathione-Sepharose o tramite IMAC su Ni: dosaggio proteico, saggio di attività enzimatica, valutazione della purezza con SDS-PAGE, calcolo del peso molecolare. (8 ore)
2) HPLC: separazione ed analisi di risultati per il monitoraggio di degradazione di inquinanti e farmaci per via enzimatica. (4 ore)
3) TLC: separazione di prodotti di interesse applicativo e industriale (coloranti sintetizzati da sistemi enzimatici, ammine, DBT). (4 ore)
4) visualizzazione grafica di macromolecole (iMol, Pdb Viewer) (2 ore)
Testi consigliati e bibliografia
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- A.J. Ninfa, D.P. Ballou. Metodologie di base per la biochimica e la biotecnologia. Zanichelli (2000).
IC Wilson, J. Walker. Metodologia biochimica: le tecniche biochimiche in laboratorio. Ed. Raffaello Cortina (1995).
R.L. Dryer, G.F. Lata. Metodologia biochimica Ed. Delfino (1993).
E fortemente consigliato lutilizzo del seguente materiale per approfondimenti e integrazioni:CD-rom contenente il materiale didattico utilizzato per le lezioni e le esercitazioni.
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Note
Modalità d'esame: orale- Oggetto: