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Metodologie Biochimiche

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Anno accademico 2007/2008

Codice dell'attività didattica
B8059
Docente
Francesca Valetti (Titolare del corso)
Corso di studi
laurea i^ liv. in biotecnologie - a torino
Anno
3° anno
Tipologia
Indirizzo Industriale
Crediti/Valenza
6
SSD dell'attività didattica
BIO/10 - biochimica
Oggetto:

Sommario insegnamento

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Programma

Introduzione: la cellula come unità funzionale e composti biologici da analizzare e caratterizzare. Condizioni da rispettare in vitro

Tecniche di estrazione di macromolecole: tessuti animali e vegetali (tecniche di omogeneizzazione), organismi monocellulari (colture microbiche). Metodi di recupero di proteine esocellulari, endocellulari e di membrana. Tecniche di lisi di pareti e membrane. Proteine espresse in sistemi diversi da quello naturale

Metodi di dosaggio proteico ( Lowry, Bradford, acido bicinconinico) e valutazione dell’attività enzimatica.

Tecniche di precipitazione. Precipitazione isoelettrica, con solventi, metalli, PEG. Solubilità delle proteine e precipitazione salina ( saltino in e saltino out). Filtrazione, dialisi, concentrazione del campione. Congelamento e liofilizzazione

Tecniche cromatografiche: cromatografia su strato sottile. Cromatografie su colonna: scambio ionico, interazioni idrofobiche, gel filtrazione, affinità, cromatofocusing. HPLC, FPLC, gas-cromatografie.

Tecniche elettroforetiche, SDS-PAGE, isoelettrofocalizzazione, elettroforesi bidimensionale. Colorazioni specifiche e aspecifiche per elettroforesi di proteine e glicoproteine. Tecniche di densitometria, elettroeluizione, blotting ed elettroblotting.

Struttura primaria di una proteina Composizione in aminoacidi, degradazione di Edman. Sequenze N- terminali e sequenze interne. Scelta delle proteasi

Tecniche di spettrometria di massa (PMF con Maldi, ESI-Ion trap)

Struttura secondaria e terziaria di una proteina e valutazione di metalli catalitici e strutturali e di centri redox: dicroismo circolare, NMR, EPR, spettroscopia di assorbimento atomico, ENDOOR; EXAFS, RAMAN, voltammetria ciclica e titolazione spettroelettrochimica.

Evidenziazione di componenti glicidiche legate a proteine: siti di glicosilazione, glicidi N e O linked,  sequenze glicidiche,  evidenziazione  con tecniche  di  spot-test  (PAS  e immunoperossidasi).

Tecniche spettrofotometriche e spettrofluorimetriche.

Metodi di cristallizzazione di proteine a confronto e determinazione della struttura per diffrattometria.

Introduzione all’allestimento di sensori proteici.

Esercitazioni:

1) Cromatografia di affinità per la purificazione di un enzima espresso come proteina di fusione su Glutathione-Sepharose o tramite IMAC su Ni: dosaggio proteico, saggio di attività enzimatica, valutazione della purezza con SDS-PAGE, calcolo del peso molecolare. (8 ore)

2) HPLC: separazione ed analisi di risultati per il monitoraggio di degradazione di inquinanti  e farmaci per via enzimatica. (4 ore)

3) TLC: separazione di prodotti di interesse applicativo e industriale (coloranti sintetizzati da sistemi enzimatici, ammine, DBT). (4 ore)

4) visualizzazione grafica di macromolecole (iMol, Pdb Viewer) (2 ore)

Testi consigliati e bibliografia

Oggetto:

A.J. Ninfa, D.P. Ballou. Metodologie di base per la biochimica e la biotecnologia. Zanichelli (2000).

IC Wilson, J. Walker. Metodologia biochimica: le tecniche biochimiche in laboratorio. Ed. Raffaello Cortina (1995).

R.L. Dryer, G.F. Lata. Metodologia biochimica Ed. Delfino (1993).

E’ fortemente consigliato l’utilizzo del seguente materiale per approfondimenti e integrazioni:

CD-rom contenente il materiale didattico utilizzato per le lezioni e le esercitazioni.



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Note

Modalità d'esame: orale
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Ultimo aggiornamento: 22/09/2008 10:14
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